1957: Professor Henry „Indiana“ Jones Jr. wird zusammen mit seinem Kollegen Mac von sowjetischen Agenten unter der Leitung von Oberst Dovchenko und Irina Spalko entführt. Er soll für sie in einer Lagerhalle des Militärkomplexes Area 51 nach einer Kiste mit den Überresten eines nichtmenschlichen Wesens suchen. Während Jones versucht, zu entkommen und zu verhindern, dass die Russen die Kiste entwenden können, entpuppt sich Mac als russischer Kollaborateur. Jones flüchtet vor den Agenten, denen es gelingt, die Kiste zu entwenden. Auf der Flucht gerät er in ein Atomtestgelände und überlebt nur knapp eine nukleare Explosion, da er sich im letzten Moment in einem mit Blei ausgekleideten Kühlschrank in Sicherheit bringen kann.
Jones verliert seine Professur an der Universität, da ihn die US-Regierung verdächtigt, ein russischer Doppelagent zu sein. Daraufhin entscheidet er sich, die Stadt zu verlassen, wird aber von dem jungen Mutt Williams dazu bewogen zu bleiben, weil Professor Oxley, ein alter Freund von Jones, in Schwierigkeiten steckt. Mutt zeigt Indy einen verschlüsselten Brief von Oxley, der ihm durch seine Mutter übersandt wurde, die zusammen mit Oxley verschwand, und in dem von einem Kristallschädel die Rede ist, von dem Indy und Oxley während ihrer Studienzeit schwärmten. Also machen sich Jones und Mutt auf den Weg nach Nazca (Peru), um mit Hilfe des Briefes der Spur von Oxley und Mutts Mutter zu folgen.
In Peru besuchen die beiden Oxleys Zelle, in der dieser aufgrund seiner geistigen Verwirrtheit eingesperrt war. Er befindet sich zwar nicht mehr in der Heilanstalt, aber sie erhalten durch seine Aufzeichnungen an den Wänden und am Fußboden Aufschluss über seine Forschung über den Kristallschädel und wissen nun, wo sie suchen müssen.
Indy und Mutt reisen weiter, um auf einem Friedhof nach dem Kristallschädel zu suchen. Nachdem sie einen Angriff von mit Schädeln maskierten „Eingeborenen“ abwehren konnten, finden sie schließlich den Schädel im Grab des Konquistadors Francisco de Orellana. Allerdings wurden sie auf ihrem Weg unbemerkt von Mac verfolgt, so dass sie vom russischen Militär gefangen genommen werden. In ihrem Lager im Amazonasgebiet im Nordosten Perus treffen Indy und Mutt auf den verwirrten Professor Oxley sowie auf Mutts Mutter – diese entpuppt sich als Indys alte Liebe Marion Ravenwood.
Nachdem sich Indiana Jones einem Test mit dem Kristallschädel unterziehen musste, der es möglich macht, mit dem Schädel zu kommunizieren, gelingt es ihm, zusammen mit Mutt, Marion und Oxley aus dem Lager zu entkommen. Sie werden allerdings schnell wieder gefasst, da Indy und Marion in eine Sandgrube einbrechen. Im Angesicht des Todes offenbart Marion Indy, dass er Mutts Vater ist. Als Mutt zurückkommt, um Marion und Indy zu retten, kommt er statt mit einem Seil mit einer Schlange zurück. Marion wird herausgezogen, doch Jones weigert sich zunächst wegen seiner Angst vor Schlangen, diese anzufassen, doch er überwindet seine Angst schließlich und wird ebenfalls aus der Sandgrube gezogen. Plötzlich erscheint jedoch das russische Militär, weil der verwirrte Oxley dem Befehl Indys, „Hilfe“ zu holen, nachging.
Da der Kristallschädel zu seinem Herkunftsort, einer legendären Stadt aus purem Gold, zurückgebracht werden muss, bahnen sich die Russen mit ihren Gefangenen ihren Weg durch den Dschungel. Indy gelingt es schließlich, die Kontrolle zurückzugewinnen, und es beginnt ein Kampf im Zuge des Dschungel-Konvois, den Indiana Jones und seine Freunde für sich entscheiden können. Oberst Dovchenko wird im Dschungel von Riesenameisen getötet. Mac behauptet, als Doppelagent gearbeitet zu haben, und kämpft von nun an wieder an der Seite von Indiana Jones.
Als sie zum Tempel gehen wollen, werden sie von Eingeborenen angegriffen, können den Angriff jedoch abwehren, weil die Eingeborenen Angst vor dem Kristallschädel haben. Die Gruppe erreicht die legendäre Stadt und öffnet die Pforte zu dem Tempel, in den sie den Kristallschädel zurückbringen müssen. Die Russen konnten der Gruppe jedoch folgen, da Mac sich doch als Überläufer entpuppt und Peilsender auf dem Weg verteilte, obwohl er ursprünglich behauptete, ein Agent der CIA zu sein. Die Russen nehmen Oxley den Schädel wieder ab, um ihn selbst an seinen Platz zurückzubringen. Damit hat nun auch das letzte der dreizehn Kristallskelette, die in dem Tempel auf Thronen sitzen, seinen Schädel wieder, und die Schädel setzen ihre Kraft frei.
Die Wesen wollen aus Dank den Menschen etwas schenken, und Irina wünscht sich das gesamte Wissen der Welt. Doch als die Wesen ihr das Wissen direkt ins Gehirn einspeisen, erkennt Irina zu spät, dass die schiere Menge des Wissens ihre geistige und körperliche Aufnahmefähigkeit so sehr übersteigt, dass sie bei lebendigem Leibe verbrennt. Der Tempel beginnt einzustürzen, und sowohl Irinas Männer als auch Mac, den Indy trotz des Verrats noch zu retten versucht, sterben entweder in den Trümmern oder werden in das Portal der fremden Wesen gezogen. Indy und seine Freunde entkommen nur knapp und können beobachten, wie ein Raumschiff aus dem einstürzenden Tempel aufsteigt und verschwindet, danach stürzt das gesamte Tal ein und wird mit Wasser geflutet.
Wieder zu Hause, erhält Indiana seine alte Stellung an der Universität zurück und der Film endet mit der Hochzeit von Indy und Marion. Indys Hut rollt dabei Mutt vor die Füße, doch bevor dieser ihn aufsetzen und damit quasi in die Fußstapfen seines Vaters treten kann, nimmt Indy den Hut wieder an sich.