Der Film beginnt mit einer Collage aus Szenen, Zeitungsausschnitten und Kommentaren über den Fall eines kleinen Mädchens namens Daisy Armstrong. Dieses wird im Jahr 1930 in den USA aus dem Hause ihrer Eltern, reicher und hoch angesehener Bürger, entführt und trotz Zahlung des Lösegeldes später ermordet aufgefunden.
Fünf Jahre später: Der belgische Detektiv Hercule Poirot hat gerade in Jordanien einen Fall abgeschlossen und reist übers winterliche Istanbul zurück nach London. Als er ein Abteil im Kurswagen Istanbul-Calais des nächsten Orient-Expresses möchte, stellt sich heraus, dass der Zug ausgebucht ist. Mit Hilfe seines Freundes Signor Bianchi, des Direktors der Compagnie Internationale des Wagons-Lits (CIWL), erhält Poirot doch noch einen Platz im Schlafwagen. Im Speisewagen macht Samuel Ratchett dem Detektiv ein äußerst lukratives Angebot, ihn zu beschützen. Ratchett gibt an, dass er regelmäßig Morddrohungen erhalte und deshalb nur noch mit einer Waffe unter dem Kissen schlafe. Poirot lehnt das Angebot ab.
Nachts wird Poirot mehrmals von merkwürdigen Geräuschen geweckt. Am nächsten Morgen wird Ratchett tot aufgefunden, er ist mit zwölf Messerstichen ermordet worden. Poirot deutet die nächtlichen Geräusche im Nachhinein so, dass Ratchett um etwa 1:15 Uhr ermordet worden sein muss.
Inzwischen ist der Expresszug auf freier Strecke zwischen Vinkovci und Slavonski Brod in Jugoslawien in einem heftigen Schneetreiben steckengeblieben. Keiner kann den Zug verlassen, auch der Mörder nicht. Der Telegraf streikt, und die jugoslawische Polizei kann nicht benachrichtigt werden. Daher wird Poirot von dem ebenfalls mitreisenden Eisenbahndirektor Bianchi um die Aufklärung des Falles gebeten, zumal jener hofft, durch die schnelle Aufklärung des Falles böse Schlagzeilen rund um den Orient-Express zu vermindern.
Im Abteil des Toten findet Poirot einen halb verbrannten Brief, aus dem er auf die wahre Identität des Toten schließen kann: Es handelt sich um den Mafioso und Schwerverbrecher Cassetti, der fünf Jahre zuvor der Drahtzieher hinter der Entführung von Daisy Armstrong war, sich jedoch durch Flucht einer gerechten Strafe in den Vereinigten Staaten entziehen konnte. Neben dem Tod der kleinen Daisy führte Cassettis Verbrechen zu weiteren Todesfällen: die Mutter von Daisy erlitt durch den Schock eine Fehlgeburt, woraufhin sie und das Baby starben. Der Vater von Daisy starb daraufhin durch Suizid. Ein Dienstmädchen, das fälschlicherweise der Mittäterschaft verdächtigt wurde, beging ebenfalls Suizid.
Im Laufe der Ermittlungen verhört Poirot nicht nur alle Reisenden, sondern findet auch ein Taschentuch mit Monogramm, einen Pfeifenreiniger sowie eine Uniform eines Schlafwagenschaffners, jedoch gibt niemand zu, Besitzer dieser Dinge zu sein.
Poirot präsentiert den Reisenden am Ende seiner Ermittlungen zwei Lösungen. Die erste und aus seiner Sicht einfachere Lösung ist, dass Cassetti von einem rivalisierenden Mafioso ermordet wurde. Die zweite Lösung ist seiner Meinung nach komplexer. Seinen Ermittlungen nach waren alle Reisenden in irgendeiner Form in Verbindung mit dem Hause Armstrong, ob als Angestellte, nahe Verwandte oder Freunde der Familie. Durch die Entführung oder deren Folge verloren sie alle einen geliebten Menschen.
Die Erklärung dafür, dass es Poirot nicht möglich war, einen der zwölf verdächtigen Fahrgäste widerspruchsfrei als Täter zu identifizieren, ist die, dass sie alle den Mord gemeinschaftlich begingen: Alle Verdächtigen sind nacheinander durch das Abteil von Ratchett/Cassetti gegangen, und jeder hat einmal auf ihn eingestochen. Es handelt sich um die Großmutter Daisys (Mrs. Hubbard), die Tante und den Onkel (Gräfin und Graf Andrenyi, die zusammen einen Dolchstoß ausgeführt haben), um das Kindermädchen Daisys (Greta Ohlsson), um den Butler (Mr. Beddoes), die Köchin (Hildegard Schmidt), den Chauffeur (Mr. Foscarelli), die Sekretärin der Armstrongs (Miss Debenham), um die Patin (Prinzessin Dragomiroff), um einen Freund von Daisys Mutter (Mr. McQueen), um einen Freund von Daisys Vater (Col. Arbuthnot) sowie um den Vater (Schlafwagenschaffner Pierre Paul Michel) und den Freund (Mr. Hardman) des verstorbenen Dienstmädchens.
Poirot lässt keinen Zweifel daran, dass er diese Erklärung für die zutreffende hält, stellt Signor Bianchi aber vor die Wahl, welche Theorie er der jugoslawischen Polizei für diesen Fall präsentieren möchte: entweder die Geschichte von einem in den Zug eingedrungenen und als Schaffner verkleideten Unbekannten, der Ratchett im Auftrag der Mafia ermordet habe, oder die vom gemeinschaftlichen Mord der zwölf Reisenden. Bianchi entschließt sich dazu, der jugoslawischen Polizei die einfachere Lösung mit dem ominösen Fremden zu präsentieren. Der Zug wird aus dem Schnee befreit, und die Reisenden stoßen miteinander an – zum leichten Missfallen Poirots, der trotz Sympathien mit seinem Gewissen ringt.